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FUG系列玻璃台式反应器使用

接种/分装

火焰圈保护接种

准备工作:操作人数以3人最佳,非操作人员离开房间,操作人员带好口罩,隔热手套;关闭门窗、空调风扇;3人分别负责持接种钳、传递种瓶和接种。
注意:严禁带橡胶或者塑料薄膜手套,一旦发生烧伤会更严重。
 用湿抹布盖住搅拌电机以及周围管道,以防止电机和硅胶管被烧坏。
 向火圈棉花上滴酒精至饱和并置于接种口。
 关小进气流量,全开尾气阀门。
 预先拧松接种口盖子。
 持接种钳者用接种钳钳住接种口盖子,点燃火圈,用接种钳拧下接种口盖子,并置于接种口远离接种者方向,盖子内测朝向火焰。
 传递种子瓶者将捆扎棉线解下,如是棉塞,将棉塞外部包裹纱布曲线,递给接种者。
 接种者在火焰旁边取下种瓶纱布或棉塞,火烧种瓶瓶口一圈后缓慢将种子液倒入罐中。然后递给传递种瓶者,同时,传递种瓶者将下一瓶种子递给接种者。
 所有接种完成后持接种钳者拧上罐盖,用湿抹布熄灭火圈,恢复罐压和通气并根据工艺设置其他参数和自控。
注意: 预先估计接种时间,保证火焰时间足够长,如果种瓶数量较多,预先合瓶。
注意:接种速度不宜过快,否则可能会导致种子液溢出,导致无菌失效。
注意:接种后和种瓶上部温度很高,禁止手持种瓶上部。
注意:严禁向燃烧的火圈上添加酒精。
注意:火圈掉落地面后立即用湿抹布覆盖。

发酵液分装/蠕动泵接种

发酵液分装一般在现场操作,需要火焰保护;蠕动泵接种在无菌操作台进行。
发酵液分装/蠕动泵接种准备阶段需要将无菌快接装置与补料口连接,用止水夹夹死,末端用纱布和牛皮纸包扎。
 在无菌操作台(蠕动泵接种)或者火焰保护下(发酵液分装)将无菌快接头两侧牛皮纸和纱布取下,并对接。
 打开止水夹,用蠕动泵或压力将种子或者发酵液压入罐内。
 接种/分装结束后发,用止水夹夹住反应器侧无菌接头连接软管,断开无菌接头,并将反应器放回操作台。
 连接反应器通气、温控、电极等所有需要的连接。
 控制面板上设置流量到工艺流量,打开空气进气管上止水夹,并观察确认有气体进入。
 连接尾气管路到尾气缓冲瓶,全开尾气至过程质谱阀门,通过尾气阀门控制罐压在0.03-0.05MPa。
 待压力稳定后,小心的打开无菌接头软管上的止水夹,将软管内残余液体排出然后重新夹死。
 设置其他参数为工艺参数,并根据需要设置自控。

培养

补料

补料瓶制作

 棉塞补料瓶:取合适大小方形双层纱布,中间依照补料硅胶管管径大小穿孔,瓶内硅胶管长度到平底,将纱布蒙住瓶口,硅胶管置于中央,逐层填充棉花,直到纱布进入瓶内2/3,继续在瓶口堆棉花,然后扎紧纱布。
注意:棉花不能使用医用脱脂棉。
注意:瓶内管口要斜切,防止吸附到瓶壁无法出液。
注意;棉花填充松紧程度以拔出棉塞能听到砰的一声为好。
 蓝盖瓶补料瓶:使用蓝盖瓶专用打孔瓶盖和不锈钢内盖,其中内盖两接头朝向外侧,单接头朝向内侧。内测连接硅胶管,长度到瓶底;外侧与内侧硅胶管连通口连接约2米硅胶管,另一口连接约20厘米硅胶管并在末端连接呼吸器。
 连接补料针头/无菌快插接头:将硅胶管出口一侧连接补料针头/无菌快插接头,并用扎带或者棉绳扎紧。
 直接连接发酵罐:补料硅胶管不连接补料针头/无菌快插接头而是直接连接到发酵罐,并随发酵罐一同灭菌。灭菌时,用止水夹夹死硅胶管。

补料瓶的计量

 记录空瓶质量(包括棉塞和硅胶管),固体料质量,溶解后质量,消后质量。
 瓶中溶液质量浓度=固体料质量/(消后质量-空瓶质量)

补料瓶的消毒

 将补料针装入无盖的10mL离心管,在离心管口处对折,用纱布和牛皮纸包扎。
 在补料管靠近瓶口处用棉线或者止水夹加紧管道。
 放入灭菌锅消毒。

针插式补料接口连接

 拧松补料接口帽。
 点燃酒精棉球并置于补料口旁边。
 拧开补料接口。
 取出补料针。
 对准补料硅胶垫中心位置,竖直扎入。
 熄灭酒精棉球。
 用就行棉球塞住补料针周围位置。
 管道装入蠕动泵并加紧。
 打开止水夹即可按工艺补料。
注意:消泡和pH控制的补料瓶制作同上,以下不再叙述。氨水、甲醇等易挥发物质不能进行高温消毒。
5L玻璃反应器只有一个针插式补料接口,一批发酵多次使用会增加染菌几率。

无菌快插接头连接

 在火焰保护下,连接无菌快插接头并固定。
 打开止水夹即可按工艺补料。

自动/手动补料

 手动补料:按下面板上手动补料按钮,补料泵将持续转动,直到到达所需补料量。
 自动补料:按下面板上自动补料按钮,补料泵将按照设定的占空比控制泵的开停。

换料

 当一瓶补料接近用完时,在控制面板上停止自动或者手动补料。
 如果有对应的称重计量,将累计按钮复位。
 将补料管用止水夹夹住并从蠕动泵上取下。
 按照上述方法将一瓶新的补料连接到补料接口上。
 如果有对应的称重计量,将新的补料瓶放置到原来的电子秤上并将累计按钮置位。
 继续按照工艺补料。
注意:如果没有按照要求置为或者复位累计按钮,会使得补料累计不准确。
注意:5L罐只有一个针插式补料接口,多次使用此接口会增大染菌概率,5L罐应尽量避免换料。

消泡

 手动消泡,按下面板上手动按钮,消泡泵将持续转动泵入消泡剂。
 自动消泡,连接好液位传感器,当有泡沫时,系统报警,同时启动消泡泵,按照设定的占空比补加消泡剂。
 作为补料,按下消泡模式,可将消泡泵作为补料泵使用,方法同上所述。

pH控制

 首先确定发酵过程中pH控制方向,在面板上确认控制方式。
 连接好酸(碱),点下面板上的pH自动。当pH向控制方向的反方向偏移超过设定值后,就会自动补加酸(碱)。

取样

准备工作

 发酵罐准备阶段,按照下图示意,连接软管2和5,并用止水夹夹住5的末端。
 如果发酵液中有固体,并且可能堵塞取样口,则将1和2断开,将1封堵,将过滤器到发酵罐之间软件加装三通,额外的开口与2断开侧连接,灭菌时用止水夹夹住三通到3之间的软管。

取样

 取样前首先用止水夹夹住图中2所示软管,小心打开软管5的止水夹,即可完成取样。

取样结束

 打开软管2止水夹,罐体顶部的空气就可将取样管内残余的液体排出。

取样口示意图 1. 罐顶压力平衡口 2. 平衡口连接软管 3. 取样口压力平衡口 4. 取样口 5. 取样口连接软管

结束

停止发酵

 用止水夹夹死过滤器到罐体之间管路。
 关闭所有自控(温度、pH、流量、搅拌、DO)
 尾气缓冲瓶排气阀门全开,到质谱阀门关闭。
 压力表读数到零后,断开排气管路和尾气缓冲瓶的连接,空气进气管和发酵罐的连接以及循环水接头与控制柜的连接。
注意:禁止带压状态断开空气进气管或者关闭空气。
 取下搅拌电机,妥善放置。
 小心的取出pH和DO电极,清洗后妥善放置。

灭活发酵液

 依次拧下罐盖固定螺丝,小心的取出罐盖。
 根据需要将发酵液灭活处理。

清洗

 玻璃罐体内外洗干净,对于有夹套的罐体,从上排水口进水将夹套底部可能的沉积物清理干净。
 将罐盖部分包括挡板、桨叶、轴封等位置用毛刷清理掉发酵液残余,并冲洗干净。
 取下接种补料复用接口,清洗干净。
 清洗电极接口、空气分布器等。
 清洗其余部分。
 清洗完成后将反应器组装复位。

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